NHS 酯反应化学
NHS 酯是通过羧酸盐分子的碳二亚胺活化形成的反应基团（参阅碳二亚胺交联剂化学）。NHS 酯活化的交联剂和标记化合物在生理至弱碱性条件下（pH 7.2 至 9）与伯胺反应，形成稳定的酰胺键。反应释放出 N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）
NHS 酯水解与伯胺反应产生竞争。水解速率随缓冲液 pH 值的增加而增加，低浓度蛋白质溶液中的交联效率降低。在 pH 7.0 和 0°C 下，NHS-酯化合物的水解半衰期为 4 至 5 小时。在 pH 8.6 和 4°C 下，该半衰期降低至 10 分钟。在不含伯胺的水溶液中，NHS 酯水解的程度可以在 260 至 280 nm 处测量，因为 NHS 副产物在该范围内吸收峰。
NHS-酯交联反应最常在室温或 4°C 下于 pH 7.2-8.5 的磷酸盐、碳酸盐-碳酸氢盐、HEPES 或硼酸盐缓冲液中进行（0.5-4 小时）。与伯胺缓冲液（例如 Tris，TBS）不相容，因为它们会发生竞争反应。但是，在某些步骤中，结合步骤结束时可添加 Tris 或甘氨酸缓冲液以淬灭（停止）反应。
低浓度叠氮化钠（≤3 mM 或 0.02％）或硫柳汞（≤0.02 mM 或 0.01％）通常不会明显干扰 NHS-酯反应，但浓度较高时会产生干扰。不纯的甘油和高浓度甘油（20-50％）也会降低反应效率。
Sulfo(磺基)-NHS 酯除了在 N-羟基琥珀酰亚胺环上含有磺酸根（–SO3）外，其他部分与 NHS 酯相同。该带电基团对整个化学反应没有影响，主要用于增加含有它们的交联剂的水溶性。此外，带电基团可防止Sulfo-NHS 交联剂穿过细胞膜，使它们可用于细胞表面交联。