《最后的晚餐》是基督教传说中最重要的故事，几乎所有的宗教画家都有描绘。然而，在达芬奇为米兰格雷西修道院的食堂画《最后的晚餐》之前，所有的画家在处理画面的艺术形象时都有一个相同的特点:即犹大与所有的门徒分开，画在餐桌的对面，处于孤立的位置接受审判。这是因为画家无法表达人们内心的复杂感受，在形象上难以区分善恶。因为达芬奇对人的形象和心理做了深入的观察和研究，他能从人物的动作、手势、表情中洞察人物微妙的心理活动并表现出来。
画家选择了耶稣得知自己被门徒犹大出卖的时刻，派门徒彼得通知他在岳跃节的晚上与门徒共进晚餐，不是为了晚餐，而是为了当众揭发叛徒。耶稣坐下后，即席说:“你们中间有一个人出卖了我。”此话一出，在场弟子一阵骚动，大家纷纷响应符合自己性格的这句话:有的表白对老师的忠诚；有的人不糊涂，要求追查是谁；有的问长辈，整个现场一片焦灼。以前的画家无法表现这种复杂的场景和他的弟子们不同的内在精神活动。只是芬奇从对现实生活中各种人格的观察中获得了不同的人格形象，所以他在绘画中塑造了不同的人物形象。观众可以从自己的生活经历出发，对画中人进行不同的心理分析。
画家所描绘的弟子们的心理和情态，在现实生活中的类似模型中都能找到，而叛徒的形象却很难画出来。为了塑造犹大的形象，莱昂纳多·达·芬奇已经停止写作几天了。他经常站在画前沉思。当时芬奇画画按时领工资，但院长因为接下来几天不写而非常恼火，他打算扣芬奇的工资。院长通过经理把想法告诉了芬奇，芬奇说了停笔的原因。虽然经理能理解，但扣工资不是他的本意，是院长的意愿。这时，芬奇转过头来看着院长，马上说他可以很快完成犹大的形象。如果他实在找不到犹大的模型，就把院长的头像画成犹大，经理会意地笑了。后来，米兰大公来看芬奇完成的画。当他看到院长坐在犹大的座位上，他笑着说:我也收到僧侣的指控，说他克扣僧侣的薪水。他就像犹大一样，让他永远坐在这里吧。大公对芬奇说:“他对你不公平，你巧妙地报复了他。”芬奇用院长做榜样，并不是出于个人报复，而是因为他发现院长和犹大贪财，本质上是一样的。因此，犹大作为贪婪、背叛和邪恶的典型进入了芬奇的作品。
这幅挂在格雷琴神庙饭堂墙上的宏伟画卷工整、均衡、富于变化，从构思完美、情节紧凑、人物塑造典型、表现手法娴熟等方面来看，堪称画家艺术的代表。它也是人类最好的画作之一，达芬奇因为它的出现而闻名于世。