原名彼得·帕克(Peter Parker)，在奥斯本集团举办的科技展上再次被变异蜘蛛咬伤，从而获得了类似蜘蛛的特殊能力。与其他关于蜘蛛侠的作品不同，本片中的小蜘蛛不再是他曾经的独行侠。他也有自己的队友和高科技装备。更独特的是，我们的小蜘蛛可以突破第四堵墙，与片外观众对话。
能力:蜘蛛般的力量、速度、灵敏和对危险的快速反应，但他并不像蜘蛛一样自由地射网，而是用自己智慧发明的、命名为“蜘蛛网发射器”的装置射蜘蛛丝。加入SHIELD后，设备得到了改进，可以拍出更高质量的网和电击网。
铁拳
原名丹尼尔·兰德(Daniel Rand)，来自昆仑的武术家，通过了不死之龙——寿老的考验，获得了铁拳铁拳的称号，将成为下一任昆仑之王。长老给了他一年的时间告别外界，他却选择加入神盾局对抗邪恶。第二季铁拳将回到昆仑接受王者使命，但长老是他带大的，加入的还有蜘蛛侠等伙伴。
能力:在昆仑修炼多年，成为格斗高手，力量，速度，神经反应都有了空前的提高。通过长寿的考验，他得到了铁拳，足以碾压一切目标。第二季铁拳被蝎子激怒，激发了内心的力量，从而获得了第二个“铁拳”。
白虎
艾娃·阿亚拉是继祖父和父亲之后的第三代“白虎”，他的力量来自家族的白虎护身符。父亲死后，他继承了它，获得了白虎的力量。他的死敌是亨特·克雷文，因为他杀了他的父亲。
能力:敏捷的速度，超强的弹跳力，锋利的指甲可以自由伸缩。加入神盾局后，我得到了一个电爪。
强力男(强力男)
卢克·凯奇，本名卢克·凯奇，父母是神盾局的科学家，发明了一种可以让人获得超人力量的血清。在另一次飞机失事中，凯奇的父母喝了血清让他活下来，并把他推下了飞机。凭借血清赋予的力量，卢克·凯奇活了下来，成为了一个奇迹般的人。第二季我们会发现凯奇的父母并没有死，而是被天蝎欺骗了。
能力:血清赋予其超强的力量和坚不可摧的皮肤。
新星
萨姆·亚历山大，新星军团的最后一名成员，有一个功能强大的头盔。他曾经是银河守护者的一员，后来退出了，成为了神盾局的一员(好像不太喜欢和外星生物长期生活在一起)。《银河护卫队》特别版第三季，Nova启发头盔升级为黑盔，实力也有所加强。蜘蛛侠称之为“终极新星”。
能力:高速飞行，能量束，全身强光(但会消耗大量能量)。它的能力由新星头盔提供。头盔升级后，强度也增强了。
尼克拉斯·约瑟夫·弗瑞
神盾局导演，领导能力强，个人行动能力强，曾出演漫威漫画除漫画外的多部影视作品。在原版漫画(616宇宙)中，尼克·弗雷是白人，但在本片中，他的设计更接近终极世界(1616宇宙)和电影世界(19999)。
菲尔·菲尔·科尔森。
为了更好地配合蜘蛛侠等人的活动，动画组成为彼得高中的校长，将学校和彼得的家改造成了斯坦·李，一个拥有各种秘密通道和高科技的神秘基地。
尼克·弗雷恩是学校的特工，也是神盾局的老成员。他平时在学校做清洁工，暗中监视学校发生的一举一动。在第二季第十五集中，他帮助彼得·帕克和他的两个朋友(玛丽·简和哈利·奥斯本)对付蜥蜴博士(库尔特·康纳斯)，但在此之前，蜘蛛侠并不知道他的身份。
熟悉漫威漫画的朋友应该知道，本片中斯坦·李的原型是漫威漫画中众多著名人物的创造者(包括蜘蛛侠、钢铁侠、x战警、神奇四侠、绿巨人..........)和《神盾局》的创作者之一。他本人也是漫威漫画电影的客串王，在几乎所有的漫威漫画电影和动画中都有几秒钟的场景。但是，我们的父亲斯坦·李像这样在一部作品中打了很长时间的酱油，并有一个特别的插曲，这似乎是第一次。